人神经干细胞培养方法

制备神经干细胞扩增完全培养基

1. 将NSC补充剂及L-丙氨酰-谷氨酰胺加入到神经干细胞培养基中。
2. 在无菌操作环境下，将20mL的NSC补充剂和5mL的200mM L-丙氨酰-谷氨酰胺（终浓度2mM）添加至480mL的NSC培养基中，混合后即得到神经干细胞扩增完全培养基。
3. （可选）可在培养基中添加10mL/L抗生素（青霉素-链霉素）溶液。注意：所有成分需在2°C至8°C的黑暗环境中储存，且有效期可达4周。
4. 在悬浮培养中可选择添加200μM抗坏血酸。

包被孔板

1. 使用基质胶包被培养板：将6孔板或12孔板每孔加入1mL或0.5mL的即用型基质胶，轻轻晃动以确保完全覆盖，然后放入37℃培养箱孵育1-2小时。
2. 实验前将其取出，在超净工作台室温平衡20分钟。如暂不使用，可用Parafilm封口后储存在2-8℃下，建议在1周内用完。
3. 使用前将已平衡的即用型基质胶弃掉，加入预热的完全NSC培养基。

NSC传代

1. 当细胞达到90-100%的融合度时，弃掉培养瓶中的培养基。
2. 用5mL不含钙和镁的预温DPBS洗涤细胞并吸弃溶液。
3. 向每个培养瓶中加入10mL预热的人多能干细胞消化液，室温孵育2-5分钟，确保完全覆盖细胞。
4. 用倒置显微镜观察细胞是否已脱离，必要时可轻轻拍打培养瓶促进细胞脱离。
5. 轻轻上下移液，将细胞团分散成单细胞悬液。
6. 加入9mL预热的NSC完全培养基终止解离反应，并将悬液转移至无菌离心管中。
7. 以200×g离心4分钟，弃去上清，用适量的NSC完全培养基重悬细胞。
8. 使用自动细胞计数器测定活细胞密度，并根据需求进行进一步的操作。

NSC冻存

1. 准备干细胞冻存液。
2. 遵循NSC传代的步骤进行细胞收集。
3. 在离心过程中计算细胞密度并确定所需的最终体积。
4. 将细胞重悬于NSC完全培养基后，加入等量的冻存液，使终浓度达到10%DMSO。
5. 将细胞悬液等分放入冻存瓶中并在冷冻设备中以标准程序实现低温保存，准备转移至液氮中。

NSC复苏

1. 在37°C水浴中迅速解冻冻存细胞。
2. 将冻存液转移至无菌的离心管中，并小心滴加预热的NSC完全培养基以重悬细胞。
3. 加入预热的培养基至10mL，200×g离心4分钟并确认细胞沉淀。
4. 加入预热的完全培养基重悬细胞，随后添加Y27632并转移至包被的组织培养瓶中孵育。
5. 复苏后24小时内更换为新鲜的培养基，以保持细胞最佳状态。

神经干细胞诱导形成脑类器官

原代细胞培养准备工作

1. 准备CO2培养箱、超净台、冷冻离心机等设备。
2. 准备所需的试剂和耗材，包括动物脑类器官培养基、基质胶等。

操作流程

1. 将基质胶在4℃融化并预冷所需器材。
2. 进行加胶、点板和加液操作。
3. 培养至类器官达到适当直径后进行传代。

促使基质胶与类器官分离

通过适当的离心机和离心条件，促进基质胶和类器官的有效分离，以确保后续的培养和使用。